中文名稱(chēng)：豬腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液KIT
中文別名：豬腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液KIT
中文別名：豬腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液KIT
豬腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
本品用于分離豬腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞
技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0018SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：
| 名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | |
| A | XXXX 動(dòng)物組織淋巴細(xì)胞分離液 | 200ml | |
| B | 樣本稀釋液（贈(zèng)品） | 2010C1119 | 200ml |
| C | 清洗液（贈(zèng)品） | 2010X1118 | 200ml |
| D | F 液（贈(zèng)品） | F2013TBD | 200ml |
| E | 說(shuō)明書(shū) | 1 份 | |
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
- 首先制備組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見(jiàn)“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。
- 取一支 15ml 離心管，加入與組織單細(xì)胞懸液等量的分離液（注：分離液最少不得少于
3ml）。
- 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據(jù)組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件，組織單細(xì)胞懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。
- 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
- 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
- 250g，離心 10min。
- 棄上清。
- 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
- 250g，離心 10min。
- 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
分離圖例
【注意事項(xiàng)】
- 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
- 本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
- 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
- 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí)，分離效果更佳。
- 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)聯(lián)系研謹(jǐn)生物技術(shù)以尋求幫助。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 | 白細(xì)胞 | 血小板 | |||
| （4.0-10.0）×109 | |||||
| 含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | （1.0-3.0）×1011 |
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% | |||
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
- 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
- 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
- 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
- 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
| 出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | |
| 離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
| 離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 | |
- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
- 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
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