服務名稱: western blot服務
規格: 實驗服務
實驗步驟:
一、試劑準備
1. SDS-PAGE試劑: 見聚丙烯酰.胺凝膠電泳實驗。
2.勻漿緩沖液: 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml; 10%SDS 6.0 ml; β-巰基Z醇0.2 ml; ddH2O 2.8 ml.
3.轉膜緩沖液:甘氨酸29g; Tris5.8g; SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH20定容至1000 ml.
4.0.01 M PBS(pH7.4): NaCl8.0g; KC10.2 g; Na2HPO4 1. 44 g; KH2PO4 0.24 g;加ddH20至1000ml。
5.膜染色液:考馬斯亮蘭0.2g;甲醇80 ml;乙酸2 ml; ddH2O118 ml。 包被液(5%脫脂奶粉，現配) :脫脂奶粉1.0 g溶于20 m的0.01 M PBS中。
6.顯色液: DAB 6.0 mg; 0.01 M PBS 10.0ml; 硫酸鎳胺0.1 ml; H202 1.0 μl。
二、蛋白樣品制備
1.單層貼壁細胞總蛋白的提取
(1)倒掉培養液， 并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液(或將瓶直立放置一釓使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
(2)每瓶細胞加3 ml 4°C預冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。
(3)按1m裂解液加10 μl PMSF (100 mM)，搖勻置于冰上。(PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)
(4)每瓶細胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側(動作要快)， 然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 mI離心管中。(整個操作盡量在冰 上進行。)
(6)于4°C下12000 rpm離心5 min。(提前開離心機預冷)
(7)將離心后的.上清分裝轉移倒0.5 m的離心管中放于- 20°C保存。
2.組織中總蛋白的提取
(1)將少量組織塊置于1 ~ 2 m勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。
(3)幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上， 要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
(4)裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 mI離心管中,然后在49C下12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20°C保存。
3.加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細胞脫落 下來，所以除按1操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取:
(1)將培養液倒至15 m|離心管中，于2500 rpm離心5 min.
(2)棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復洗滌--次。
(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF) 冰上裂解30 min,裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
(4)將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起49C、 12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 mI離心管中并置于- 20C保存。
三、蛋白含量的測定
1.制作標準曲線
(1) 從- 20°C取出1 mg/ml BSA, 室溫融化后,備用。
(2)取18個1.5 mI離心管, 3個-組，分別標記為0 mg, 2.5mg, 5.0mg，10.0 mg, 20.0mg， 40.0mg。
(3)按下表在各管中加入各種試劑。
(4)混溝后， 室溫放置2 min。在生物分光光度計(Bio-Photometer, Eppendorf). 上比色分析。
2.檢測樣品蛋白含量
(1)取足量的1.5 m離心管，每管加入4°C儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。 室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
(2)取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCI容液100 ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。
(3)空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用無菌水洗- -次。
(4)取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCI NaCI溶液和5 mI待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min, 倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意:每測一個樣品都要將比色杯用無水Z醇洗2次，無菌水洗- -次。 可同時混合好多個樣品再一起測，
這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5 mI樣品含的蛋白量。
四、SDS- PAGE電泳
1.清洗玻璃板
--只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2.灌膠與上樣
(1)玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時要 使兩玻璃對齊以免漏膠。)
(2)按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 m槍吸取5 m膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。(灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠-定要沿玻璃板流下， 這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。)
(3)當水和膠之間有一條折射線時， 說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
(4)按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待
到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
(5)用水沖洗-下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內， 大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另- -邊要墊一塊塑料板且有字的- -面面向外。)
(6)測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 m離心管中，加入5xSDS.上樣緩沖液至終濃度為1x。( 上樣總體積-般不超過15 μl,加樣孔的最大限度可加20 μ樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
(7)加足夠的電泳液后開始準備上樣。(電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。 )用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣 品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下-個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。
3.電泳
電泳時間一般4 ~5h,電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。
五、轉膜
1.轉一 張膜需準備6張7.0~ 8.3 cm的濾紙和1張7.3 ~ 8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時-定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的- 邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸
濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一-層空 氣膜，這樣會阻止膜吸水。
2.在加有轉移液的搪瓷盤 里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、-支玻棒、濾紙和浸過的膜。
3.將夾子打開使黑的一 面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上)，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
4.要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬-會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。(撬時一 定要小心，玻板很易裂。)除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作)，要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路。(轉移液含甲醇， 操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。)
5.將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h. .
6.轉完后將膜用1x麗春紅染液染5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。
六免疫反應
1.將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。
2. 將抗用TBST稀釋至適當濃度(在1.5 m離心管中) ;撕下適當大小的-塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗-次，10 min.
3.同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1 ~2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗- -次， 10 min,進行化學發光反應。
七、化學發光,影，定影
1.將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合; 1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸; 1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液，包好,放入X-光片夾中。
2. 在暗室中,將1x顯影液和定影液分別到入塑料盤中;在紅燈下取出X -光片，用切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大1 cm) ;打開X-光片夾，把X -光片放在膜上，- 旦放上,便不能移動，關上X光.陜，開始計時;根據信號的強弱適當調整曝光時間，-般為1 min或5 min,也可選擇不同時間多次壓片，以達zui佳效果;曝光完成后，打開X-光片夾， 取出X-光片, 迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間-般為1~2 min (20~ 25°C)，溫度過低時(低于16°C) 需適當延長顯影時間;顯影結束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間-般為5 ~ 10 min,以膠片透明為止;用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
應注意的是:顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片,否則會對結果產生影響。
八凝膠圖象分析
將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。
展開
注意事項:
1.一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。
2.顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。
其他:
一、免疫反應
1.用0.01 M PBS洗膜，5 min x3次。
2.加入包被液，平穩搖動，室溫2 h。
3.棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 minx3次。
4.加入一抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部)，49C 放置12 h以上。陰性對照，以1%BSA取代-抗，其余步驟與實驗組相同。
5.棄-抗和1%BSA,用0.01 M PBS分別洗膜，5 minx4次。
6.加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋)，平穩搖動，室溫2 h。
7.棄二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 minx4次。
8.加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
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